— 特发性肛门瘙痒症患者直肠黏膜感觉受体表达情况研究 —

特发性肛门瘙痒症患者直肠黏膜感觉受体表达情况研究

特发性肛门瘙痒症是临床常见肛周疾病之一，患者通常仅有肛周瘙痒症状而无特定病理因素。很多特发性肛门瘙痒症患者经常抱怨粪便刺激后肛门瘙痒症状加重，同时尽管多数特发性肛门瘙痒症患者肛门括约肌并未受到任何损伤，但仍有很多患者可能会出现肛门潮湿、肛门坠胀感等直肠感觉阈值异常现象及低扩张容积、低直肠顺应性、直肠高压等，进而引发直肠收缩。因此，导致特发性肛门瘙痒症患者肛门潮湿、肛门坠胀感的原因除与肛管括约肌功能失调有关外，还可能与直肠黏膜感觉功能障碍有关。本研究旨在分析特发性肛门瘙痒症患者直肠黏膜感觉受体表达情况，以探讨肛门直肠感觉阈值异常与直肠黏膜感觉相关信号分子变化在特发性肛门瘙痒症患者中的作用。

1对象与方法

1.1研究对象

1.2标本采集

获得两组受试者知情同意后，采用直肠镜采集其直肠黏膜组织，具体如下：（1）标本采集前嘱两组受试者使用开塞露以排空大便，并告知其在标本采集过程中会出现轻微疼痛和肛门坠胀感，且短期内可能会出现便血，但一般3~5d会缓解；（2）采样时嘱患者取左侧屈膝卧位，在直肠镜表面涂抹石蜡油进行润滑后将直肠镜经肛门缓慢插入直肠腔内，然后缓慢退镜并在直肠下段（距离齿状线约3cm）采用活检钳钳夹直肠下段黏膜组织2~3块；（3）将钳取的直肠下段黏膜组织先分别置于4%甲醇溶液中进行固定、保存，再置于液氮进行急冻并在-80℃冰箱中保存。

本研究背景：

虽然特发性肛门瘙痒症为肛肠外科医生与皮肤科医生所熟悉，但其发病机制目前尚不明确。引起特发性肛门瘙痒症的原因有很多，涉及粪便稀疏、粪便污浊、直肠肛门抑制反射过度导致肛门括约肌松弛等，这些广泛但有时相互矛盾的病因学表明特发性肛门瘙痒症的病因、病理生理机制复杂多样。

本研究创新性及价值：

本研究采用免疫组化、实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）对特发性肛门瘙痒症患者直肠黏膜感觉受体进行定性检测与定量分析，发现其瞬时感受器电位香草酸受体1（TRPV1）、5-羟色胺（5-HT）明显升高，其直肠顺应性降低、感觉阈值升高可能与TRPV1、5-HT的过表达有关，并可能是由于直肠黏膜感觉传递中递质敏化或表型改变所致，这一推断不仅可初步解释特发性肛门瘙痒症患者多伴有肛门潮湿、渗漏、坠胀感，瘙痒多在排便后或夜间加剧的原因，也为深入研究特发性肛门瘙痒症的病理生理机制奠定了分子生物学基础。

1.3试剂与仪器

RNA提取试剂盒（RNAisoPlus）及反转录、实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）试剂盒购自TaKaRa生物股份有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其中瞬时感受器电位香草酸受体1（TRPV1）上游引物序列为5'-CATTGTGCAGATTGAGCAT-3'，下游引物序列为5'-TTCCTGCAGAAGAGCAAGAAGC-3'；5-羟色胺（5-HT）上游引物序列为5'-TGATTTGCTGGTTGGATTGTTTG-3'，下游引物序列为5'-ATGGATGCGGTTGAAAAGAGAA-3'；三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体上游引物序列为5'-GCCTCTCCGACGCCGACTG-3'，下游引物序列为5'-GGCCATCGTACCCAGAAATTG-3'；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）上游引物序列为5'-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，下游引物序列为5'-CTGTFGAAGTCGCAGGAGACA-3'。一抗：TRPV1（PTG，22686-1），5-HT（GeneTex，GTX31099），三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体（GeneTex，GTX119003）；兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：sp-90015）。显色剂：二氨基联苯胺（DAB）（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZLI-9018）。日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11显微镜，北京离心机厂LDZ5型离心机，切片机（莱卡RM2235），美国ABI7900实时荧光定量PCR仪等。

1.4方法

1.4.1免疫组化

（1）采用磷酸盐缓冲液（PBS）对钳取的直肠下段黏膜组织进行冲洗，选取<0.5cm×0.5cm×0.1cm的组织块。（2）先采用4%多聚甲醛〔0.1mol/LPBS，pH值为7.0~7.6，含0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）〕进行固定，再采用70%、90%、80%、100%乙醇进行洗涤、脱水，最后进行浸蜡、包埋。（3）采用切片机进行切片，切片厚度为5μm。（4）将切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，过夜后进行脱蜡、入水及梯度乙醇浸泡，依次进行自来水冲洗、PBS冲洗。（5）抗原修复：滴加正常山羊血清封闭液后分别滴加按比例稀释（1∶1000）的一抗，过夜后滴加生物素化二抗（IgG）。（6）采用PBS进行冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，再次采用PBS冲洗后加入DAB以显色，苏木素复染细胞核1min。（7）充分水洗后采用中性树脂封片。（8）采用显微镜（×400）进行观察并选择两组受试者阳性和阴性标本相进行显微照相、图像分析及HIS评分，其中显微镜下细胞核呈蓝色、细胞质呈深浅不一的棕色为阳性表达，否则为阴性表达；图像分析采用Image软件，并自动计算平均光密度值（MOD值）；HIS评分为阳性细胞数评分（阳性范围0~25%计1分，26%~50%计2分，51%~75%计3分，76%~100%计4分）与阳性细胞显色强度评分（阴性计0分，淡黄色计1分，浅褐色计2分，深褐色计3分）的乘积。

1.4.2实时荧光定量PCR

采用Trizol法提取两组受试者直肠下段黏膜组织总RNA，采用核酸仪测定其浓度并按照反转录试剂盒说明书反转录出cDNA，95℃预变性5min后，95℃变性15s→60℃变性40s（40个循环）；经PCR扩增后采用实时荧光定量PCR仪自带软件ABIPrism7500SDSSoftware分析TRPV1、5-TH、三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体mRNA表达情况：（1）根据阴性对照调整阈值和基线以确定各标本Ct值，并根据熔解曲线确定该Ct值是否有效；（2）采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，其中ΔΔCt=ΔCt样本均值-ΔCt阴性对照均值，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.5统计学方法

采用SPSS17.0统计软件包进行数据分析，符合正态分布的计量资料以（

±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

免疫组化结果显示，瘙痒组患者直肠黏膜组织TRPV1、5-HT呈阳性表达，三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体呈阴性表达（见图1）。瘙痒组患者TRPV1MOD值（t=8.233）及HIS评分（t=22.370）、5-HTMOD值（t=8.249）及HIS评分（t=5.980）高于健康组，差异有统计学意义（P<0.01），而两组受试者直肠黏膜组织三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体MOD值（t=1.488）及HIS评分（t=1.303）比较，差异无统计学意义（P>0.05，见图2，图3）。

图1两组受试者直肠黏膜组织TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体表达情况（免疫组化，×400）

Figure1TheexpressionofTRPV1，5-HTandP2X2inrectalmucosaltissueinpruritusandhealthygroups

图2两组受试者直肠黏膜组织TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体MOD值比较

Figure2ComparisonoftheMODvalueofTRPV1，5-HTandP2RX2polyclonalantibodyinrectalmucosaltissuebetweenpruritusandhealthygroups

图3两组受试者直肠黏膜组织TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体HIS评分比较

Figure3ComparisonoftheHISscoreofTRPV1，5-HTandP2RX2polyclonalantibodyinrectalmucosaltissuebetweenpruritusandhealthygroups

实时荧光定量PCR结果显示，瘙痒组患者直肠黏膜组织TRPV1、5-HTmRNA相对表达量高于健康组，差异有统计学意义（t值分别为7.306、8.144，P<0.01），而两组受试者直肠黏膜组织三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（t=0.457，P>0.05，见图4）。

图4两组受试者直肠黏膜组织TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体mRNA相对表达量比较

Figure4ComparisonoftherelativeexpressionquantityofmRNAofTRPV1，5-HTandP2RX2polyclonalantibodyinrectalmucosaltissuebetweenpruritusandhealthygroups

3讨论

目前，关于特发性肛门瘙痒症病因学的严格的、系统性的研究很少见，多数研究者从细菌学角度考虑特发性肛门瘙痒症的主要病因。早期研究表明，特发性肛门瘙痒症患者会出现过度的直肠肛门抑制反射并导致肛管渗漏发生风险升高[2]，因此推测特发性肛门瘙痒症患者直肠感觉阈值异常主要由内脏感觉传递神经敏化或表型改变所致，但是何种原因导致了直肠感觉功能障碍，直肠感觉阈值异常是否与直肠黏膜相关感觉信号分子表达有关？本研究以直肠黏膜感觉受体为切入点，比较了特发性肛门瘙痒症患者与体检健康者直肠黏膜TRPV1、5-HT、三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体表达情况。

3.1TRPV1

TRPV1是当前许多胃肠道疾病研究的"明星"分子，与许多胃肠道疾病的病理生理机制及治疗密切相关：TRPV1敏感传入神经激活对小鼠远端结肠和直肠扩张后内脏运动反应（VMR）的传递至关重要，在内脏反应中已有通过改变表达、增强或降低激活阈值来调节TRPV1功能的描述[3]；摄入TRPV1拮抗剂5周可有效减轻功能性消化不良志愿者内脏疼痛，但有明显不良反应[4]；TRPV1通道参与结肠高敏反应相关疾病，肠易激综合征（IBS）患者结肠黏膜TRPV1表达升高，但TRPV1的表达在IBS亚组〔混合型IBS（IBS-M）、IBS腹泻型（IBS-D）、BS便秘型（IBS-C）〕间并无统计学差异，提示TRPV1表达升高与IBS患者内脏高敏性相关[5]。BRIERLEY等[6]进行的小鼠体外实验证明，辣椒素直接激活了61%的腰内脏神经（LSN）传入纤维和47%的骶盆腔神经（PN）传入纤维，82%的胸腰和50%的腰骶结肠不同大小背根节（DRG）神经元显示瞬时受体样免疫样反应（TRPV1-likeimmunoreactivity，TRPV1-LI），PN的配对终止于腰骶脊髓并主要支配直肠感觉信号的传导，这些不同的受体表达谱意味着远端结肠和直肠区域对香草或嘌呤能刺激的化学敏感性略低于远端结肠近端区域。由上述可知，TRPV1在远端结肠和直肠敏感性、肠道动力调节方面均具有重要作用。

CHAN等[7]通过对30例健康志愿者直肠黏膜组织进行活检发现，其平均直肠热感觉阈值与排便欲望、最大耐受量密切相关，静脉注射辣椒素后其直肠产生剂量依赖的感觉，提示直肠黏膜组织存在高密度功能性TRPV1，而TRPV1能感受肠腔内各种刺激。本研究结果显示，瘙痒组患者直肠黏膜组织TRPV1MOD值、HIS评分及mRNA相对表达量均高于健康组，提示特发性肛门瘙痒症患者直肠感觉阈值增高、直肠顺应性降低与TRPV1表达增高有关。需要指出的是，虽然目前有多项关于TRPV1在内脏高敏性结直肠动力紊乱性疾病中的机制研究，但关于特发性肛门瘙痒症患者直肠黏膜组织TRPV1表达情况的研究报道较少见，且很多有争议的治疗效果和病理生理机制还需要进一步验证，因此推测特发性肛门瘙痒症患者可能存在传入神经敏化，或可能仅通过增加纤维密度而引起机械或热阈值降低，继而导致肛门瘙痒感觉增强。

3.25-HT

5-HT是肠道中重要的信号分子，在肠道感觉传导和肠道动力调节方面发挥着重要作用。研究表明，5-HT具有调节肠道运动分泌与黏膜感觉的作用，肠道5-HT的表达减少可导致肠道蠕动功能减弱及便秘，而5-HT过表达则可导致直肠感觉、运动过敏，造成便意频繁、肛门坠胀、排便不尽感等直肠高敏反应；肠嗜铬细胞是压力传感器，可将5-HT分泌到肠壁中，刺激黏膜下主要传入神经元而引起蠕动反射[8]；肠内5-HT在感觉传导中具有重要作用，可激活结肠黏膜内固有初级传入神经元和外在初级传入神经元末端[9]，而结肠黏膜5-HT主要受色氨酸氢化酶1（TPH-1）和转运蛋白（SERT）调控。MATSUMOTO等[10]通过建立葡聚糖硫酸酯钠（DSS）小鼠结肠炎模型发现，小鼠直肠黏膜神经元/非神经元TRPV1通道激活，5-HT3受体表达增加，5-HT4受体表达减少，TRPV1拮抗剂和5-HT3受体拮抗剂可使内脏痛觉过敏减轻至正常对照组水平，提示肠黏膜TRPV1通道和5-HT信号改变可能是导致结肠炎小鼠内脏高敏反应的原因之一，而内脏高敏状态与初级传入神经纤维的高敏反应相关。

本研究结果显示，瘙痒组患者直肠黏膜组织5-HTMOD值、HIS评分及mRNA相对表达量高于健康组，提示特发性肛门瘙痒症直肠感觉阈值异常可能与5-HT表达升高有关。由于5-HT可刺激直肠分泌、调节直肠收缩运动并导致直肠感觉阈值升高，而特发性肛门瘙痒症患者直肠容量增加、直肠壁反射性压力及直肠顺应性下降，因此特发性肛门瘙痒症患者肛门潮湿、渗漏除与短暂性括约肌松弛引起的括约肌功能失调有关外，还与5-HT的过表达导致直肠感觉阈值异常相关，进一步深入了解5-HT在肠道中的合成、分布、储存、释放及其对肠道感觉、运动的调控机制对治疗特发性肛门瘙痒症具有重要意义。

3.3三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体

三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体广泛分布于胃肠道，参与多种胃肠道疾病的发病，并与多种肠道功能障碍性疾病密切相关。同时，胃肠道运动神经元与感觉神经元中均有三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体的表达，说明其与胃肠道运动和感觉功能均有密切联系。吴璐一等[11]通过电针刺激IBS大鼠天枢穴、上巨虚穴发现，电针刺激能降低IBS内脏痛大鼠结肠肌间神经丛神经元三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体的表达。DEVRIES等[12]通过评估野生型（WT）、三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体和三磷酸腺苷受体受体P2X3抗体亚基敲除（KO）小鼠体内外结肠运动能力发现，烟碱受体主要分布于供给小鼠结肠纵肌的抑制性运动神经元，且包含三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体或三磷酸腺苷受体受体P2X3抗体亚基的受体并不局限于供应纵向肌肉的运动神经元，因此由包含三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体或三磷酸腺苷受体受体P2X3抗体亚基的受体介导的突触传递对于小鼠结肠的运动性并不是必需的。OHMAN等[13]通过对初生大鼠结肠注射乙酸而诱导内脏高敏反应，发现其嘌呤类受体（P2XR）的表达会大幅度增加以维持内脏高敏性，慢性功能性内脏痛觉过敏与三磷酸腺苷（ATP）诱发的反应增强和结肠特异性感觉神经元三磷酸腺苷受体单体（P2X3Rs）的表达升高有关。以上研究一定程度上揭示了功能性结肠高敏反应的特定分子机制，可能为开辟IBS及相关疾病的新治疗策略铺平道路。

WYNN等[14]采用1种新型大鼠离体结肠直肠抑制剂研究肠扩张时黏膜是否释放5-三磷酸腺苷，并评价其对直肠扩张时感觉神经放电的影响，结果发现三磷酸腺苷受体受体P2X3抗体在供应大鼠结肠直肠的背根神经节L1和S1神经元亚群中表达，结直肠扩张导致结肠上皮细胞释放的5-三磷酸腺苷压力依赖性增加，并引起盆腔神经兴奋。目前，关于三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体的表达情况及可能的调控机制研究主要集中于动物模型，关于人三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体调控机制的研究主要集中于IBS这一消化道功能性疾病，但三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体作为一种肠道扩张感觉信号传导分子，是否参与了特发性肛门瘙痒症患者直肠顺应性降低及直肠感觉阈值增强仍是一个具有争议性的问题。本研究结果显示，两组受试者直肠黏膜三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体MOD值、HIS评分及mRNA相对表达量间均无统计学差异，因此三磷酸腺苷受体受体P2X2抗体是否未参与直肠感觉阈值异常，或由于直肠顺应性降低、直肠扩张反应而未导致兴奋传导，或因为本研究样本量较小？这些均需进一步研究证实。

内脏高敏感状态指机体空腔脏器对有害刺激产生的过激反应和对生理刺激产生的不适感，与各种离子通道的激活、中枢神经致敏性、外周神经致敏性、直肠顺应性降低均相关，发病机制复杂。直肠高敏感状态属于内脏高敏状态，与直肠肠壁感觉功能相关，多种直肠高敏性直肠疾病患者均存在TPRV1、5-HT表达升高，如功能性肠病IBS、直肠炎（包括放疗后直肠炎）、直肠前切除术后综合征等。笔者所在课题组前期研究发现，TRPV1在辣椒素诱导的肛门瘙痒模型小鼠肛门皮肤中的表达明显升高，而通过温和灸治疗后TRPV1的表达明显减少，提示TRPV1通路的异常激活是特发性肛门瘙痒症的发病机制之一[15]；与正常人和便秘患者相比，特发性肛门瘙痒症患者直肠顺应性降低但直肠敏感性增加，同时特发性肛门瘙痒症患者直肠黏膜感觉受体TRPV1、5-HT的表达异常升高，因此推断特发性肛门瘙痒症患者直肠感觉阈值升高及直肠顺应性降低可能与直肠黏膜TRPV1、5-HT的表达升高有关，且TRPV1、5-HT的表达可能是由于直肠黏膜感觉传递中递质敏化或表型改变所致[16]。

综上所述，特发性肛门瘙痒症患者直肠黏膜感觉受体TRPV1、5-HT的表达明显升高，其直肠顺应性降低、感觉阈值升高可能与TRPV1、5-HT的过表达有关，并可能是由于直肠黏膜感觉传递中递质敏化或表型改变所致，但直肠黏膜感觉受体对直肠感觉与运动功能的调控是一个复杂的病理生理过程，本推断还需要谨慎地进一步研究。

本文无利益冲突。

参考文献略